By LABORATORIO 3 gy gctsa88b cbenpanR 16, 2016 15 pagos Universidad Técnica Federico Santa Maria Departamento de Ingeniería Qu[mica y Ambiental Laboratorio de Introducción a la Microbiología Practico NC 3 «RECUENTO BACTERIANO Y ANALISIS DE AGUA» CRECIMIENTO BACTERIANO Introducción Crecimiento es el incremento ordenado de todos los componentes de un organismo. La multiplicación celular es una consecuencia del crecimiento.
En organismos unicelulares la multiplicacion conduce a un aumento en el View nut*ge número de individuo lugar a una población El crecimiento micro concentración celula número de células p celular (peso seco de PACE 1 oris au no ou rse términos de e cultivo) o densidad las células por unidad de volumen de cultivo). Estos dos parámetros no siempre son equivalentes, debido a que el promedio de peso seco de la célula varia en las distintas etapas de la historia del cultivo.
Cinética exponencial Durante la fase exponencial de crecimiento, la tasa de incremento de la masa bacteriana en un tiempo determinado es proporcional a la masa presente: dB/dt suele ser la que se emplea para representar curvas de crecimiento bacteriano. Suele ser útil xpresar la tasa de crecimiento como tiempo de duplicación (tD), denomnado también tiempo medio de Universidad Técnica Federico Santa María Departamento de Ingeniería Química y Ambiental generación (TMG).
Este valor se obtiene asignando a Bt el valor 2Bo en la ecuación 4 ( es decir, el doble): In BUBO – Ir,2 = ntD tD = (1/0) 2 = 0,69 (110) El valor recíproco del TMC, C (= 1/tD), es la tasa constante de crecimiento exponencial, expresada en generaciones por hora. Su valor es 1,45 veces mayor que la tasa constante de crecimiento instantáneo C], ya que el valor de B, y, por tanto, de 08, umenta continuamente durante el crecimiento exponencial, y cuando se duplica la masa bacteriana, la tasa de síntesis celular se duplica con respecto al instante inicial (ver Figura de gráfica).
RECUENTO DE MICROORGANISMOS El recuento es un procedimiento que permite conocer el número de microorganismos que hay en una muestra. para este propósito, existen diferentes métodos mediante los cuales se pueden contar microorganismos vivos (recuento de viables), o bien vivos y mu to de totales). A su vez 2 OF todos los tipos de microorganismos. Departamento de Ingeniería Qu(mlca y Ambiental 1 Recuento de Totales ) Recuento de Breed Es un método que entrega recuento de totales. Se utiliza para recuento de microorganismos en la leche.
Para realizar este método usted, sobre un porta objetos limpio y desengrasado dibuje con un lápiz un cuadrado de un centímetro cuadrado. Homogenice la muestra problema y con una pipeta Pasteur coloque una gota de la muestra (aproximadamente 0,01 ml) sobre el cuadrado y extiéndala bien sin salirse de Seque y fije al calor suavemente, luego cubra la extensión con cristal violeta durante un minuto. Lave con agua y seque. Observe al microscopio con aceite de inmersión. Cuente el número de microorganismos en varios campos, no menos de 5.
Luego calcule el promedio de microorganismos contados y multiplique por 3000 (área del campo del microscopio) y por 100 (inverso del inoculo colocado en el cuadrado). NO de células/ml = X de células por campo x 3000 x 100 3000, corresponde al área del campo del microscopio y debe ser calculado para cada uno, o referirse al fabricante. 100, corresponde al inverso del inoculo depositado en el portaobjeto. b) Recuento con cámara d ser o Hemocitómetro. porta y el cubreobjeto. La excavación completa tiene 25 cuadrados cada uno dividido en 16 uadrados más pequeños. ara calcular el número de células por ml de muestra, se debe hacer la siguiente operación: Contar las células presentes en varios cuadrados grandes y sacar promedio. Multiplicar el promedio por 25 (con esto se obtiene el NO de células en un mm2). Multiplicar por 50 (esto entrega el número de células en un mm3). Multiplicar por 1000, para transformar todo a cm3. NO ceVml = X cel x 25 x 50 x 1000 Este recuento representa la cantidad de células vivas y muertas. El método es aplicable a cualquier suspensión de partículas microscópicas. c) Recuento con sales de tetrasolium.
Las sales de tetrasolium son un compuesto que se agrega a la preparación, el cual se reduce como producto del metabolismo y las células se tiñen de color rojo. Las células muertas quedan sn teñir (el compuesto no es utilizado y queda insoluble). d) Recuento por Microscopia de Fluorescencia. Las bacterias se tiñen con naranja de acridina, compuesto que es capaz de integrarse al DNA bacteria las células vivas quedaran generalmente se efectúa determinando la cantidad de células de una población que son capaces de dividirse y formar colonlas.
El método de conteo en placas es el más ampliamente usado dos son las versiones de esta técnica: la placa vertida y la placa extendida. a) Método de la placa extendida En el método de la placa extendida, una muestra generalmente pequeña de 0,1 ml se extiende asépticamente sobre la superficie de una placa de cultivo con el medio adecuado y bien seco y se incuba hasta que las colonias son visibles a simple vista. Se entiende que cada colonia se originan de una sola célula por lo tanto contando el número de colonias se puede calcular la cantidad de células viables de la muestra. ) Método de la placa vertida Con el procedimiento de la placa vertida, la muestra se mezcla on el agar el cual debe encontrarse a una temperatura de 45 a 500C colocándose posteriormente sobre la placa de Petri estéril. Los microorganismos quedan entonces fijos dentro del agar y forman colonias. Con las placas servidas se pueden emplear volúmenes de muestra de ml o más, siendo posible el recuento de lodos o suspensiones como las que se obtienen de alimentos o medios homogeneizados.
Una desventaja importante de esta técni s OF que los microorganismos I breve calentamiento del célula viable, si se pone en medio de cultivo adecuado, dará lugar a una colonia. Además de su ensibllidad, el recuento en placa permite también la identificación positiva del organismo que se va a contar, en vista de que la colonia formada puede semir como inoculo para un cultivo puro puede a su vez ser identificado taxonómicamente. Más aun, puesto que organismos diferentes frecuentemente producen colonias diferentes en forma, textura, tamaño y color, diferentes tipos de organismos pueden contarse en una mezcla.
Una de las principales suposiciones en los procedimientos para el recuento en placa es que cada colonia se origina de una sola célula, pero sin por el azar dos células quedan dispuestas uy cerca de una de la otra, durante la incubación, pueden dar origen a una sola colonia fusionada, que no puede diferenciarse de la que se originó de una sola célula. La experiencia práctica ha determinado que debe haber menos de 300 colonias por cada placa de cultivo para minimizar el problema. c) Método de las diluciones y plaqueo (viables).
Se toma 0,1 ml de un cultivo problema bien homogeneizado con una pipeta estéril y se diluye progresivamente en tubos con 9 ml de solución salina estéril al 0,8% de NaCl. En lo posible se recomienda hacer cada dilución con una pipeta nueva omogeneizando bien la suspensión en cada paso. Se obtienen así las siguientes diluciones: 10-1 , 10-2 10-3 . 0-8 , 10-9, 10-10 6 OF De las tres últimas se toma 0,1 ml y se siembra en la superficie de una placa de Petri con agar nutritivo bien seco y posteriormente con un asa de Drigalsky se homogeniza la siembra por todo el medio el cual debe estar bien seco.
Incubar las placas a la temperatura adecuada de crecimiento durante 24-48 horas. Una vez incubadas las placas, cuente el número de colonias que aparecen en cada una de ellas y saque un promedio. Tome en cuenta las placas que contengan entre 30 y 00 colonias solamente. Luego el valor promedio del número de colonias multiplicado por el valor rec[proco de la dilución correspondiente y por 10 (colocamos 0,1 ml de inoculo) nos da el número de microorganismos por ml de la muestra problema.
NO cel/ml X colonias x factor de dilución x 10 Ejercicio: Si en la placa correspondiente a la diluclón 10-8 aparecen 38 colonias, el número de microorganismos viables por ml de muestra inicial será? d) Método Turbidimétrico. Un medio de cultivo estéril, que ha sido inoculado va presentando turbidez a medida que la población celular va en aumento. Este fenómeno puede ser medido en un espectrofotómetro. Se coloca un volumen medido de cultivo, en un tubo especial de vidrio transparente de diámetro e es interpuesto entre una unidad de foco células.
El porcentaje de tramitancia de la luz a través del tubo se relacionará de manera inversa con la turbidez del tubo. Este método es rápido, sencillo y puede determinarse el número de células correspondiente a cada lectura por recuento en placa. Con él se puede confeccionar la curva de crecimiento de un cultivo bacteriano, información necesaria cuando se desea trabajar con cultivos en fase exponencial. Figura El espectrofotómetro. (a) El espectrofotómetro mide la turbidez, es decir, la cantidad de luz que transmite un cultivo, expresada en unidades de absorbancia.
La célula bacteriana dispersa la luz, de manera que no es detectada por el detector sensible a la luz. (b) El tubo de la izquierda no tiene células bacterianas y está transparente. El de la derecha contiene alrededor de mil millones (109) de células por mililitro y, por lo tanto, está turbio. (c) La curva patrón relaciona la absorbancia con el número de células bacterianas por mililitro. Una vez que se obtiene, esta curva puede usarse para convertir ualquier medida de absorbancia en número de células.
Por ejemplo, a partir de esta curva, una lectura de 1,6 unidades de absorbancia significa que el cultivo contiene 100 millones (108) de células por mililitro e) Número más probables nismos. Es posible hacer determin nteo de viabilidad (NMP). En esta técnica, la muestra que va a ser contada se diluye hasta que la densidad celular sea de menos de 1 célula por ml. En estas condlciones ya no es apropiado hablar de concentraciones de células, sino más bien de la probabilidad de encontrar una célula. or ejemplo, si existen 5 células en 0 ml, la concentración puede expresarse como S x 10-1 células por ml. Sin embargo, las células viables son desde luego individuales, por lo tanto, decimos que en este ejemplo existe una probabilidad de 0,5 por cada ml del tubo de que contenga una célula viable. Si el tubo se vaciara tomando 10 muestras de 1 ml cada una, 5 de ellas se esperaría que contuvieran una célula y 5 que carecieran de ella. Este concepto es la base del procedimiento del NMP.
Se toma una cantidad de muestra pequeña por duplicado (generalmente 1 ml), de una muestra diluida, y cada una de ellas es inoculada en un tubo eparado de medio fresco de crecimiento, que posteriormente es incubado para permitir la proliferación del microorganismo. Los tubos que reciben una célula mostrarán crecimiento (proliferación) y los que no la tienen no mostrarán crecimiento. La proporción de tubos inoculados que muestran crecimiento es una medida de la probabilidad que se acaba de mencionar.
Esta probabilidad puede convertirse nuevamente a concentraci la muestra, considerando NMP. Las tablas del NMP son una derivación estadística del número más esperado o más probables de células que produciré el patrón de crecimiento bservado. para que llegue a ser útil es procedimiento del NMP, la muestra debe diluirse lo suficiente, sino se hace esto, todas las muestras contendrán células viables y todos los tubos inoculados mostrarán crecimiento cuando se incube.
Por el contrario, si la muestra ha sido muy diluida, ninguno de los tubos inoculados mostrará crecimiento. El método está diseñado para trabajar con series de 3, 5 y 10 tubos por cada dilución. Cuando mayor sea la cantidad de tubos empleados, mayor será la precisión del método. El método del número más probable (NMP) proporciona un recuento de viables. Al aumentar el factor de dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos contienen sólo un organismo y los otros, ninguno.
A partir del número, determinado por los tubos que presentan turbidez en tres diluciones sucesivas (en este caso 5, 3, 1), puede determinarse el número más probable de células. Este valor, multiplicado por el factor de dilución nos proporciona el número de células viables de la muestra. Universidad Técnlca Federico Santa Maria El método del NMP se utiliza para contar microorganismos que son difíciles de cultivar en medio sólido. ambién eterminar el número de
