By Hidrocarbonoclastas gyJanncttcFP nexa6pp 03, 2010 25 pagcs Redalyc Sistema de Información Científica Red de Revistas Científicas de América Latina, el Caribe, España y Portugal Hernández-Acosta, Elizabeth;Ferrera-Cerrato, Ronald;Gutiérrez- Castorena, María del Carmen;Rodríguez-Vázquez, Refugio, Rubiños-panta, Juan Enrique;FernándezLinares, Luis Bacterias y hongos hidrocarbonoclastas de rizósfera frijol y maíz, en un suelo contaminado con petróleo TERRA Latinoamericana, vol. 21, Núm. 4, octubre-diciembre, 2003, pp. 493-502 Universidad Autónoma Chapingo México Disponible en: http://redalyc. uaemex.
Wsrc/inicio/ArtPdfRed. jsp PACE 1 or2s TERRA Latinoamerica terra@correo. chapin México ¿Cómo citar? Número completo mx p A a): 0187-5779 orna Chapingo Más información del articulo Página de la revista www. redalyc. org Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto BACTERIAS Y HONGOS HIDROCARBONOCLASTAS DE RIZOSFERA FRIJO Y MAÍZ, EN UN SUELO CONTAMINADO CON PETRÓLEO Hydrocarbonoclastic Bacteria and Fungi of the Rhizosphere Las poblaciones microbianas se multiplican rápidamente en la zona rizosfénca, aumentando las posibilidades de remoción del contaminante.
Con la finalidad de abundar más en este tema, el presente trabajo tuvo como objetivo estudiar la relación de bacterias hidrocarbonoclastas (HCT’ s) y hongos (HCTs) aisladas de rizósferas de plantas que crecen en suelos de Minatitlán, Veracruz (Chamaecrista nictitans y Panicum sp. ) después de ser incorporadas en un suelo contaminado con 25 000 mg kg-l de petróleo crudo donde, posteriormente, se crecieron plantas de frijol (Phaseolus vulgaris L. ) y maíz (Zea mays L). También se estudió la remoción del contaminante por efecto de la interacción frijol-maíz-bacteria y hongo hidrocarbonoclastas.
En invernadero, se establecieron tres experimentos (frijol (F), maíz (M) y frijol-maíz (FM) asociados) distribuidos en un diseño experimental completamente al azar; cada experimento tuvo seis tratamientos: a) bacteria + planta, b) bacteria + hongo planta, c) sin microorganismos + planta, d) bacteria sin planta, e) bacteria + hongo sin planta y f) sin microorganismos, sin planta, con seis repeticiones. Se evaluaron poblaciones microbianas y las tasas de remoción de hidrocarburos totales del petróleo (HTP) a 28 y 48 días después de la siembra (dds). Los Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo.
Pachuca, Hidalgo. t (elizahac@yahoo. com. mx) 2 Instituto de Recursos Naturales, Colegio de Postgraduados. 56230 Montecillo, estado de México 3 Centro de Investigación de Estudios Avanzados-lnstituto Politécnico Nacional. México, D. F. 4 Instituto Mexicano del Petróleo, Departamento de Biote 2 OF as Avanzados-lnstituto Politécnico Nacional. México, D. F. 4 Instituto Mexicano del Petróleo, Departamento de Biotecnología. México, D. F. Recibido: Marzo de 2001. Aceptado: Abril de 2003. Publicado en Terra 21: 493-502. resultados mostraron mayores poblaciones de bacterias HCTs (6. 03 x 108) y hongos HCT’s (2. x 105) en la rizósfera frijol- maíz + bacteria + hongo a 48 dds. La rizósfera de maíz inoculada con bacterias (HCTs) permitió la mayor tasa de remoción HTP en la misma fecha. Se mostró la importancia que tienen los microorganismos hidrocarbonoclastas rizosféricos en la remoclón de petróleo. palabras clave: Suelos contaminados, Chamaecrista nictitans, Panicum sp. , Phaseolus vulgaris L. , Zea mays SUMMARY When plants grow in soils contaminated with petroleum, an ideal habitat is created for the development of microorganisms that are able to use petroleum as a source of carbon.
Microorganism reproduction increases in the rhizosphere, augmenting the possibilities of removing the pollutant. The objective of the present work was to study the relationship of hydrocarbonoclastic bacteria and fungi isolated from the rhizosphere of plants (Chamaecrista nictitans and panicum sp. ) growing in a polluted soil in Minatitlan, Veracruz. The hydrocarbonoclastic (HCT) bacteria and fungi were incorporated into a soil polluted with 25 000 mg kg-l of crude petroleum in which bean (Phaseolus vulgaris L. ) and corn (Zea mays L) were sown.
The removal of the pollutant as a result of the interaction mong bean, corn, HCT bacteria and fungi was studied. Three greenhouse experiments were set up with bean, as and fungi was studied. Three greenhouse experiments were set up With bean, corn and beancorn associatlon, arranged in a completely randomized experimental design. Each experiment had Six treatments: a) bacteria + plant, b) bacteria + fungi + plant, c) no microorganisms + plant, d) bacteria without plant, e) bacteria + fungi without plant, and f) no microorganisms, without plant.
Each treatment had Six replicates. Microbial populations and the removal of petroleum were evaluated 28 and 48 days after owing. The results showed the highest populations of 493 TERRA VOLUMEN 21 NÚMERO 4, 2003 hydrocarbonoclastic bacteria (6. 03 x 108) and fungi (2. 75 x 105) in the rhizosphere of bean-corn + bacteria + fungi 48 days after sowing. The rhizosphere of corn inoculated with hydrocarbonoclastic bacteria showed the highest removal rate of total petroleum hydrocarbons 48 days after sowing.
The importance of hydrocarbonoclastic microorganisms in the rhizosphere for removal of petroleum in contaminated soils was demonstrated in the present study. Index words: Soil pol ution, Chamaecrista nictitans, panicum sp. phaseolus vulgaris L. , Zea mays L INTRODUCCION En suelos contaminados con hidrocarburos, la biorremediación puede llevarse a cabo con los microorganismos que habitan el suelo, en la rizósfera de plantas ahí establecidas, esto último es mejor conocido como fitorremediación.
Durante la práctica de la fitorremediación se utilizan plantas para recuperar suelos contaminados por compuestos orgánicos como el petróleo, porque éstas remueven y destruyen a los contaminantes (Anderson et al. , 1995). Lo antenor s porque éstas remueven y destruyen a los contaminantes (Anderson et al. 1995). Lo anterior sucede debido a que en las raíces de las plantas (zona rizosférica) existe una prol’feración de microorganismos del suelo para llevar a cabo la degradaclón de compuestos orgánicos.
Así, se ha demostrado la capacidad que tienen las plantas y su rizósfera en la remoción de contaminantes como los insecticidas y herbicidas presentes en el suelo (Walton y Anderson, 1990) La fitorremediación es aplicada en pa[ses desarrollados como Estados Unidos y Canadá, y los resultados muestran la capacidad de la planta, en asociación con la microflora del suelo, para eliminar la ontaminación principalmente de compuestos orgánicos (Cunningham et al. , 1995; Slciliano y Germida, 1998). Se han desarrollado experimentos en laboratorio (Boyajian y Carreira, 1997), en semillero e invernadero (Radwan et al. 1995; Wiltse et al. , 1998) con plantas de importancia agrícola como el maíz (Amadi et al. , 1993; Hernández, 2002) y frijol (Hernández et al. , 2003) para mostrar cómo remedian suelos contaminados con petróleo y sus derivados, los resultados muestran la existencia de microorganismos rizosféricos altamente biodegradadores. En México, esta línea de investigación se inició recientemente y o es común encontrar articulas formales donde la comunidad científica dé a conocer qué es lo que se ha estudiado y cuáles son 494 objetivos alcanzados.
Por esta razón, este trabajo tuvo como objetivo estudiar la interacción de bacterias y hongos hidrocarbonoclastas (HCT’s) en las rizósferas frijol y maíz, en la remoción de petróleo crudo en un su s OF as hidrocarbonoclastas (HCT’s) en las rizósferas frijol y maíz, en la remoción de petróleo crudo en un suelo, para proponer una tecnología de limpieza que pueda aplicarse en las zonas petroleras de México. MATERIALES Y MÉTODOS Aslamiento Purificación de Bacterias y Hongos Hidrocarbonoclastas Se colectaron muestras de suelos rizosféricos de la leguminosa Chamaecrista nictitans y del pasto Panicum sp. las cuales crecen en presencia de petróleo crudo en suelos de Minatitlán, Veracruz. A partir de suelos rizosféricos de las plantas mencionadas, se prepararon diluciones y se realizaron siembras en cajas de Petri, siguiendo las metodologías tradicionales propuestas por Clark (1 965a,b) y Parkinson (1982) en medios de cultivo minerales sólidos para el crecimiento de bactenas HCT’s y hongos HCTs, con la finalidad de obtener colonias separadas.
Los medios de cultivos utilizados fueron: 1) para el crecimiento de bacterias HCT’s, el medio de cultivo Rennie (1981) modificado y 2) para el crecimiento de hongos HCT’s, el medio de cultivo Eggins y Pugh (Leander y Curl, 1972); mismos que se describen en el Cuadro 1. En ambos medios de cultivos se excluyó la fuente de carbono. Como fuente de carbono en los medios de cultivo se agregó 2 mL de petróleo crudo por caja de Petrí que se sembró con los microorganlsmos menclonados impregnando papel flltro.
La manera en la cual se incorporó el petróleo se ilustra en la Figura . El aislamiento y purificación consistió en realizar siembras continuas de colonias separadas hasta obtener, en cajas de Petri, la presencia de una sola colonia multiplicada; es decir, un solo tipo 6 OF as obtener, en cajas de Petri, la presencia de una sola colonia multiplicada; es decir, un solo tipo de microorganismo (Granados y Villaverde, 1998; Velázquez, 1998).
Pruebas de Inducción a una Mayor Degradación La prueba consistió en lo siguiente: se introdujo una carga de bacterias u hongos, según el caso, a frascos de vidrio que contenían 50 ml_ de medio de cultivo inerales (en forma l(quida) para el crecimiento de bacterias 14C Ts y hongos HCT’s y se agregaron 2 mL de petróleo crudo maya. El frasco se HERNANDEZ ET AL. BACTERIAS Y HONGOS HIDROCARBONOCLASTAS DE RIZOSFERA FRIJOL Y MAÍZ Cuadro 1.
Medios de cultlvo utilizados para el crecimiento de los microorganismos hidrocarbonoclastas. Medio de cultivo carbón combinado (Rennie, 1981). Solución A K2HP04 KH2P04 NaC12 NapeEDTA Na2M004•2H20 Extracto de levadura Manitol sacarosa Lactato de sodio (60 v/v) Agua destilada Solución g MgS04•7H20 cac12 Agua destilada PH Agar g 0. 8 0. 2 0. 1 0. 028 0. 025 0. 025 5. 0 . 0 0. 5 rnL goo mL 0. 2 0. 06 100 rnL 7. 0 15 Figura 1. Ilustración de la incorporación del petróleo crudo al medo de cultivo en la caja de Petri. os parámetros: a) excelente (a tres dds), b) buena (a nueve dds), c) mediana (a 14 dds), y d) mala (más de 14 dds). Caracterización de los Aislamientos de Bacterias y Hongos Hidrocarbonoclastas Al grupo de bacterias HCT’s aisladas se caracterizó por la técnica de tinción de Gram (Velázquez, 1998), después se evaluaron: morfolog(a colonial, morfología microscópica, movilidad (Millán y Ramírez, 1998) y cinética microbiana (Granados y Villaverde, 998). ara identificar las bacterias HCT’s, se utillZó el (Granados y Villaverde, 1998). Para identificar las bacterias HCT’s, se utilizó el sistema estandarizado API 20 NE sistema de identificación de bacilos Gram negativos que no pertenecen a la familia de las Enterobacterias, el cual combina ocho pruebas convencionales y 12 de asimilación (API 20 EN, 2000).
Se determinó la morfología colonial al grupo de hongos HCT’s aislados (Chávez y Ramírez, 1998) y se caracterizaron a nivel género con la técnica de Ridell (Ridell, 1950). Preparación de Inóculo de Bacterias Hidrocarbonoclastas y Hongos Hidrocarbonoclastas Se utilizó un consorcio microbiano formado por cinco bacterias hidrocarbonoclastas representadas por los géneros Pseudomonas spa y Agrobacterium radiobacter y tres especies de hongos hidrocarbonoclastas representados por géneros Trichoderma, Aspergillus y Mucor.
Cada aislamiento de bacterias HCT’s y de hongos HCT’s se sembraron en tres frascos de vidrio con capacidad de 250 mL, los cuales, además, contenían 50 mL de medio de cultivo mineral (en estado liquido) y petróleo crudo maya como fuente de carbono. En los aislamientos de 495 Nota: Agregar y mL de biotina (5 mg L-l) en 1000 mL de medio de ultivo y a p-aminobenzoico (1 0 mg L-l) en 1000 ml_ de medio de cultivo. Medio carbón combinado modificado por Hernández et al. 2003). Solución A K2HP04 KH2P04 NaC12 NaFeEDTA Na2M004-2H20 NH4C12 Agua destilada solución B MgS04•7H20 cac12 Agua destilada pH Agar g 0. 8 0. 2 0. 1 0. 028 0. 025 0. 2 900 mL (g) 0. 2 0. 06 100 7. 0 15 Nota: Agregar y mL de biotina (5 mg L-l) en 1000 ml_ de medio de cultivo y a p-aminobenzoico (10 mg -1) en 1000 ml_ de medio de L-l) en 1000 mL de medio de cultivo y a p-aminobenzoico (10 mg L-l) en 1000 mL de medio de cultivo. erró con una tapa que presentó un tubo de vldrio, el cual se ubrió con tela hilaza y algodón para facilitar el paso de oxígeno al interior. El frasco se colocó en una incubadora-agitadora donde permaneció a 150 rpm (revoluciones por minuto) a una temperatura de 28 0C. Las pruebas de inducción a una mayor degradación se llevaron a cabo dos veces: en cada prueba se realizaron observaciones a 3, 9, 14, 30 y 60 días después de la inoculación.
Se aplicó una escala subjetiva (la cual consistió en evaluar a 3, 9, 14 y más de 14 días después de la siembra (dds) visualmente la remocón de petróleo crudo), posteriormente, se seleccionaron los mejores aislamientos de acuerdo con el estado e degradación del petróleo la cual consideró bacterias HCT’s, se consideró el tiempo de generación (22 horas en promedio), para obtener al inóculo en la mayor fase de crecimiento; posteriormente, se colectó el medio de cultivo para utilizarlo en el experimento de invernadero.
Los aislamientos de hongos HCT’s permanecieron en incubación por ocho días, tiempo necesario para que germine un número significativamente alto de esférulas o hifas, después se colectó el medio de cultivo y, al igual que en las bacterias HCT’s, se utilizó en la etapa experimental.
A los dos inóculos (colectados y omogeneizados), se les realizaron diluciones y se sembraron en cajas de Petri para conocer las unidades formadoras de colonias (UFC) mL-1, de acuerdo con la técnica de dilución y conteo en placa propuesta formadoras de colonias (UFC) ml_-l, de acuerdo con la técnica de dilución y conteo en placa propuesta por Clark (1965a,b) y Parkinson (1982).
Preparación del Sustrato Debido a la dificultad de volver a obtener muestras de suelo en Minatitlán, Veracruz, se utilizó un suelo con textura migajón arenosa, con pH 7. 8, extremadamente pobre en materia orgánica (0. 459%), pobre en contenido de nitrógeno (0. 40%), rico en contenido de fósforo (1 1. 04 mg kg-l bajo contenido de potasio (0. 340 meq/100 g), y con una capacidad de intercambio catiónico de 9. 15 meq/ 100 g, propiedades que presentan los suelos contaminados de Minatitlán, Veracruz.
Macetas, Preparación del Suelo y Llenado de las Macetas Las macetas que se utilizaron fueron envases de cerveza de 940 ml_ cortados a la altura del cuello, posteriormente se le agregaron 700 g de suelo. El petróleo crudo se mezcló con el suelo y se utilizó un recipiente de peltre y un tenedor de aluminio. Una vez obtenida la mezcla uniforme, se colocó en la maceta de vidrio. Antes de inocular y de sembrar en el suelo, éste se esterilizó.
Siembra del Material Vegetal, Inoculación y Cuidado de las Plantas en Invernadero Se sembraron semillas de frijol var. Negro INIFAP, las cuales fueron proporcionadas por el Campo Experimental Agrícola Valle de México del Instituto Nacional de Investigaclones Forestales, Agrícolas y pecuarias (INIFAP), y una colecta de maíz criollo (MV06), obtenida de plantaciones de 496 maíz en Minatitlán, Veracruz. Ambos materiales vegetales se seleccionaron porque crecen en los suelos mencionados. Al centro de cada maceta se sembraron las semillas, a un
