By Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Publica versión impresa ISSN 1726-4634 Rev. Perú. med. exp. salud publica v. 24 n. l Lima ene. /mar. 2007 ARTÍCULO ORIGINAL Estandarización y validación de una prueba de PCR para el diagnóstico precoz de Leptospirosis humana. Standardization and validation of the polymerase chain reaction for early diagnosis of human Leptospirosis Manuel Céspedes Zl a; Rafael Tapia Lla ; Lourdes Balda J lb ; Dana González Q1a ; Carlos Peralta2a Patricia Condori2a 1 Laboratorio Refere Bacteriana, Centro N de Salud.
Lima, Perú. 2 Dirección de Salud a Biólogo. OF17 Wp pase nal d irosis – Zoonosis Instituto Nacional de Dios, Perú. b Técnico de Laboratorio. RESUMEN Objetivos: Estandarizar y optimizar la prueba de PCR dirigida al gen rrs (16S) de Leptospi a spp. , para luego validar su uso en muestras de pacientes con síndrome febril captados en zonas endémicas del Perú. Material y métodos: Se estandarizó y validó una prueba de PCR para el diagnostico rápido de leptospirosis en muestras de sangre y orina.
Se optimizó la prueba con muestras de ADN de Leptospira de diferentes especies, y se determinó en 180 muestras clínicas de pacientes con sospecha de leptospirosis u sensibilidad y especificidad en comparación con la prueba de aglutinación microscópica (MAT) y ELISA IgM. Resultados: El PCR La sensibilidad y especificidad del método fue 100% in vitro. Su sensibilidad fue de 100% (IC95: 97,9 – 100%) en muestras de sangre antes de los ocho primeros días de enfermedad y de 30% (IC95: 16,3 – 43-,7) cuando el tiempo de enfermedad fue mayor.
El PCR en orina tiene una baja sensibilidad. Conclusiones: El PCR estandarizado es más sensible que las pruebas serológicas en los primeros días de enfermedad y es poco sensible cuando la carga bacteriana es baja en sangre. Palabras clave: Leptospira; Leptospirosis; Anticuerpos; Reacción en cadena de la polimerasa, Diagnóstico precoz (fuente: DeCS BIREME). INTRODUCCION La leptospirosis es una enfermedad zoonótica de distribución mundial, causada por diversos serovares de Leptospira spp. atógenas; se adquiere cuando el hombre está en contacto directo o indirecto con orina contaminada1-3. En el Perú, está distribuida ampliamente, pero no se conoce la real proporción de febriles atribuidas a esta infección, porque no es considerada usualmente como una enfermedad de notificación y tampoco s Incluida dentro del diagnóstico diferencia14-8; sin embargo, algunos estudios de vigilancia demuestran que es una causa muy frecuente de síndrome febril incluso mayor que el dengue en áreas endémicas9,10.
La enfermedad puede variar desde una infección subclínica hasta una enfermedad grave con falla multiorgánical 1, debido a la gran variedad de signos y síntomas clínicos, la leptospirosis esta siendo confundida con otras enfermedades febriles como malaria, influenza, hepatitis, dengue, fiebre amarilla, enfermedad de Carrión, entre otras7-8. La presencia de Leptospira spp. puede demostrarse 7 amarilla, enfermedad de Carrión, entre otras7-8. La presencia de Leptospira spp. uede demostrarse mediante observación en microscopía de campo oscuro o por cultivo; pero el proceso es laborioso e incluso podría tardar hasta tres meses7. Los métodos de diagnóstico más usados están basados en la respuesta inmune del paciente frente a las leptospiras, como la prueba de microaglutinación (MAT) 12 y el ELISA IgM 13, que detectan anticuerpos contra Leptospira spp. en liquido cefalorraqu(deo (LCR) y suero, pero estas técnicas son poco sensibles en los primeros seis días de enfermedad y por tanto ueden ser inoportunas para el inicio de tratamient07.
El diagnóstico precoz en leptospirosis es necesario, sobretodo en las formas graves de la enfermedadl 1; esto ha motivado el desarrollo de técnicas de PCR que han demostrado que pueden ser útiles en los periodos agudos de la infección14,15; sin embargo, no se encuentran disponibles para el diagnóstico clinico en el Perú. El propósito del estudio fue estandarizar y optimizar la prueba de PCR dirigida al gen rrs (165) de Leptospira spp. 14, para luego validar su uso en muestras de pacientes con síndrome febril aptados en zonas endémicas y comparar estos resultados con el cultivo, MATy el EL SA IgM.
MATERIALES Y METODOS ADAPTACIÓN IN VITRO Bacterias y condiciones de crecimiento Las cepas de Leptospira usadas para la estandarización in vitro fueron especies de leptospiras patógenas y no patógenas, pertenecientes a los serovares Andamana, Bratislava, Autumnalis, Ballum, Bataviae, Canicola, Celledoni, Pomona, Hebdomadis, Cynopteri, Djasiman, Georgia, Grippotyphosa, Icterohaemorrhag 30F 17 Celledonl, Pomona, Hebdomad•s, Cynopteri, Djasman, Georgia, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Javanica, Pyrogenes, Sejroe y Tarassovi; las cuales pertenecen a seis especies eptospira biflexa, . borgepetersenii, L. nterrogans, L kischneri, santarosai y L. weilii. Las cepas fueron fueron obtenidas del Laboratorio de Leptospiras del Instituto Nacional de Salud (INS) y reactivadas en medio de cultivo en medio EMJH, por cinco días a 28 oc. Las cepas de Brucella melitensis y Salmonella typhl fueron cultivados en BHI (Difco), Borrelia burdorgferi fue cultivado en medio BSK-H medium (Sigma), Treponema pallidum fue extraído de un antígeno FTA-Absorvent (Difco), el ADN de Plasmodium alciparum y Rickettsia spp. fueron proporcionados por los Laboratorios de Referencia Nacional de Malaria y Rickettsiosis del NS.
Aislamiento de ADN Las leptospiras fueron cultivadas por cinco días y centrifugadas a 2000 g durante diez minutos. El sedimento fue resuspendido en buffer TE/sod10 (50 rnvl Tris, 50 mM EDTA. 100 Naci, PH 8,0), y luego se adicionó 30 il_ de SDS al y 3 de proteinasa K, para incubarlo a 37 0C durante una hora. La suspensión de las células lisadas se trataron con fenol: cloroformo: alcohol isoamilico (25:24:1 ) y los ácidos nucleicos fueron precip tados con os volúmenes de etanol frío y luego resuspendidos en agua de PCR estéril.
Para la optimización del PCR se trabajó con 25 muestras de ADN de leptospiras patógenas y no patógenas y a partir de éstas se evaluó la sensibilidad. Posteriormente seis cepas fueron mezcladas individualmente con muestras de sangre y estas se extrajeron con diferentes métodos: MI: D PAGF40F 17 extrajeron con diferentes métodos: MI: DNAzol (GIBCO), M2: DNAzol y extracción orgánica, MS: DNAzol modificado, M4: esferas de CHELEX 100 (SIGMA), V15: método convencional, Ms: método convencional modificado, MI: método de precipitación.
Además se diluyeron de 107 hasta 102 leptospiras en muestras de sangre y se extrajeron con kits de extracción de ADN los cuales fueron Perfect DNA Blood (Eppendorf), Ready Amp Genomic (Promega), Qiamp DNA Blood (Quiagen), Chelex 100 (Sigma) y DNA zol modified (Gibco). para orina se probaron cuatro métodos (método convencional-lisis buffer, Chelex 100, DNAzol modificado y B0iIing 16).
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Se realizó la optimización de todos los parámetros del PCR como primer, cloruro de magnesio, dNTPS, taq polimerasa, buffer y ADN. Para los estudios de especificidad de la prueba de PCR se robaron con tres muestras de ADN de los siguientes patógenos (Brucella mellitensis, Salmonella typhi, Treponema pallidum, Borrelia burdorgferi, Rickettsia typhi y Plasmodium falciparum).
VALIDACION CON MUESTRAS CLINICAS (IN VIVO) Lugar de estudio Para la validación en campo se enrolaron pacientes con sospecha clínica de leptospirosis que acudieron a cinco establecimientos de salud de la Dirección de Salud de Madre de Dios (Hospital Santa Rosa y Iberia, Centro de Salud Jorge Chávez, Nuevo Milenio y Laberinto), adicionalmente se captaron muestras de pacientes ebriles en un brote de leptospirosis al sur de Lima en San Vicente de Cañete.
Se incluyeron aquellos pacientes febriles que residían en el área de estudio un mínimo Cañete. de estudio un mínimo de dos meses, con una edad comprendida entre los 5 y 65 años, que presentaron un tiempo de enfermedad menor de diez días, con temperatura oral mayor o igual a 38 cc, con malestar general, cefalea repentina y asociada a uno o más signos y síntomas como escalofrío, mareo, mialgia, artralgia, tos, disnea, diarrea, náuseas o vómitos, hemorragia conjuntival, fenómenos hemorrágicos, ictericia y oliguria.
Muestra biológicas Las muestras biológicas se tomaron en el primer contacto con el establecimiento de salud, se obtuvo 5 mL de sangre total en tubo al vacío con anticoagulante EDTA, otro tubo de 5 mL de sangre sin anticoagulante y además se obtuvo 15 ml_ de orina, previo consentimiento informado. Posteriormente, entre los 7 a 21 días después de tomado la primera muestra se tomó la muestra pareada de sangre sin anticoagulante. De la muestra de sangre con anticoagulante se realizó el PCR y cultivo, la muestra de sangre total fue centrifugada y se separó el suero, a partir del ual se realizaron las pruebas de ELISA IgM y MAT.
El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto Nacional de Salud, Lima, Perú. Exámenes de laboratorio El cultivo se realizó en dos tubos con medio EMJH, a estos se agregó 2 a 3 gotas de sangre anticoagulada por medio, luego se incubaron a 28 a 30 0C, los tubos se observaron semanalmente por un lapso de tres meses, después se descartaron. El ELISA IgM se realizó usando un kit de ELISA que usa como antígeno un pool de serovares patogénicos, preparado en el Instituto Nacional de Salud-Perú; en una eva 6 7
Instituto Nacional de Salud-perú; en una evaluación previa mostró una sensibilidad y especificidad mayor al 95%13. Asimismo, se realizó la prueba de aglutinación microscópica (MAT). El MAT se realizó utilizando los siguientes serovares: Andamana, Bratislava, Autumnalis, Ballum, Bataviae, Canicola, Celledoni, Pomona, Hebdomadis, Cynopteri, Djasiman, Georgia, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Javanica, Pyrogenes, Sejroe, Tarassovi y un nuevo serovar Varilla112. La extracción de muestras ADN de sangre se realizó con el kit Qiagen, y para las muestras de orina se utilizó un método que se asa en el uso de la resina Chelex 100.
Criterios de confirmación Se consideró como caso positivo cuando hubo seroconversión en muestras pareadas (de serología negativa a positiva o aumento de anticuerpos en dos o más títulos), cuando se tuvo en una sola muestra ELISA IgM positiva y MAT positiva con título mayor a 1/400, o cuando se tuvo cultivo positiv07. ANALISIS DE DATOS Se calculó la sensibilidad y especificidad con su respectivo intervalo de confianza al 95%(lC95) del PCR optimizado, en muestras de sangre y orina usando el sofware estadístico Epidat 3,1. RESULTADOS
ESTANDARIZACION DEL PCR para el PCR se uso el primer ribosomal correspondiente al gene rrs 16SRNA Lep A: 5′ GGCGGCGCGTCTTAAACATG3 ‘ y Lep g: S ‘TVCCCCCCATTGAGCAAGATV3 cas condiciones de la mezcla que se estandarizó fue 100 pmol de cada primer, 1,5 mM MgC12 (Perkin Elmer), IX PCR Buffer II (Perkin Elmer), 200 iM dNTPsy1 IJ er) en un volumen final de AmpliTaq DNA polimer 7 7 de 50 LIC. de AmpliTaq DNA polimerasa (Perkin Elmer) en un volumen final de 50 pc Las condiciones se ciclaje fueron: desnaturación inicial de 95 0C por cinco minutos, 95 0C por 30 segundos, 59 cc por 1 minuto, 2 0C por 30 segundos, este ciclo se repitió 30 veces.
Una vez terminado se hizo una extensión final a 72 0C por siete minutos en un termociclador Amplitron II (Thermolyne). SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD IN VITRO Los primer usados durante la estandarización del PCR amplificaron los 25 serovares de leptospiras que están agrupados en seis especies, estos serovares son usados en el MAT y son de biflexa (2), borgepetersenii(4), L. interrogans(14), L. kischneri(l), L. santarosai(3) y weilii(l). En las amplificaciones realizadas se muestran bandas bien marcadas (Figura 1 y 2). De las muestras de ADN de otros agentes patógenos (Brucella mellitensis, Salmonella typhl, T. allidum, Borrelia burdorgferi, Rickettsia typhi y P. falciparum) no se amplificó ninguno de ellos usando este primer. Para este número de cepas y con estas bacterias podemos afirmar que la sensibilidad in vitro del método es de 100% y su especificidad es también de 100%. EVALUACION DE LA EXTRACCION DE ADN CON MUESTRAS DE SANGRE Y ORINA. De ocho serovares evaluados por siete métodos, sólo se amplificó adecuadamente y se observó una banda con los métodos M3, M4, M5, M6 y M7 (Tabla 1). Los kits que detectaron leptospiras en las muestras diluidas fueron Quiamp DNA Blood, Perfect DNA Blood y Chelex 100 (Tabla 2).
Para orina se encontró que la resina Chelex 100 fue el método más adecuado para los procesos de extracción de ADN y posterior PCR (Tabla 3). VALIDACION 80F 17 el método más adecuado para los procesos de extracción de ADN y posterior PCR (Tabla 3). VALIDACION DE LA PRUEBA EN CAMPO Se recolectaron 194 muestras, pero se excluyeron 14 debido a que no tenían muestras de sangre anticoagulada. para determinar la sensibilidad y especificidad, se evaluaron 1 53 rocedentes de Madre de Dios y 27 de San Vicente de Cañete.
La sensibilidad del PCR en sangre, antes de los ocho primeros días de enfermedad es de 100% (IC95: 97,9 – 1 00%) y detecta más casos que la MAT o ELISA evaluados en forma individual o conjunta (Tabla 4), sin embargo, su sensibilidad disminuye al 30% (IC95: 1 – 43-,7) cuando se evalúan muestras de ocho o más dias de enfermedad. Su especificidad es muy buena independientemente del tiempo de enfermedad del paciente. El PCR en orina es poco sensible, aunque en combinación con el PCR en sangre ayudó a encontrar seis casos más (Tabla 4). DISCUSION
Se logró desarrollar un PCR sensible y específico en base a los primers publicados por Menen et al. 14 para la detección precoz de la infección por Leptospira spp. El método desarrollado es capaz de detectar el ADN de leptospiras patógenas y no patógenas, pero no puede diferenciar los serovares entre los serogrupos de leptospiras. La Inhabilidad de poder diferenciar entre leptospiras patógenas y no patógenas puede ser una dificultad en estudios ambientales donde se quiera diferenciar entre los distintos serovares; sin embargo, no tiene importancia en el aspecto clínico, pues no se aisla Leptospira biflexa en uestras humanas 17,18.
El PCR desarrollado no tuvo reacciones cruzadas con muestras de patógenos causantes de infecciones El PCR desarrollado no tuvo reacciones cruzadas con muestras de patógenos causantes de infecciones que clínicamente pueden ser similares a las ocasionadas por las leptospiras en zonas endémicas del Perú (Brucelosis, fiebre tifoidea, sífilis, borreliosis, tifus y malaria), similares resultados se obtuvieron por otros investigadores 15,19. Los experimentos realizados con el DNA purificado indican que pequeñas cantidades de bacteria pueden ser detectadas por el
PCR, tanto en muestras de sangre como de orina. Sin embargo, se obtuvo pocos aislamientos en las muestras clínicas que se trabajaron, debido a diferentes problemas intrínsecos de la propia bacterial . Esta prueba es de utilidad en los primeros días de enfermedad, donde tiene una sensibilidad del 100% en muestras de sangre, detecta más casos en momentos precoces de la enfermedad a diferencia del MAT y el ELISA (Tabla 4) y permite obtener los resultados en el mismo día (a diferencia del cultivo que puede demorar entre una a ocho semanas para tener el resultado)7.
Por llo, el PCR es una técnica que podr(a reemplazar al cultivo debido a su alta sensibilidad demostrada en el estudiol 8. Esta alta sensibilidad y su superioridad a los resultados obtenidos por MAT y ELISA en momentos precoces de la enfermedad, ha sido confirmado recientemente por otros estudios20,21, demostrando que el PCR en sangre es de particular ayuda en aquellos casos sospechosos no confirmados por las técnicas serológicas20, o que en combinación con ellas se aumenta la sensibilidad de las pruebas de laboratorio hasta 96% en casos sospechosos de leptospirosis21. Son pocos los estudios que usan las 0 DF 17
