By EXPRESIÓN DEL GEN PGKI gy andrestigreros94 OcopaTlR 16, 2015 18 pagos ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO DEL SNP rs2021 38276 DE LA ENZIMA GLICOL[TICA FOSFOGLICERATO QUINASA 1 (PGKI) Eliana Ceballes-Burban01, Andrés Felipe Tigreros-Andrade1 & Felipe Paniagua Fernández2 Facultad de Ciencias Naturales, Departamentos de 1Ciencias Biológicas y de 2Ciencias Químicas, Universidad Icesi, Cali, Colombia. Palabras claves: SNPs, bioinformática, PGKI , análisis estructural, glicolisis.
INTRODUCCION Actualmente se reall de encontrar la form variaciones a un nivel PACE 1 or18 to View nut*ge num e s con el propósito humano con las A. La mayoría de la variación genética del humano se encuentra representada por los polimorfismos de nucleótido simple (Single Nucleotide Polymorphism o SNP, en inglés), y muchos de estos se cree que pueden causar diferencias fenotípicas entre los individuos.
A pesar del empeño que se toma para encontrar el SNP responsable que conlleva a un fenotipo específico, es un proceso dificultoso de realizar [ 1]. Los SNPs son un simple cambio de base en una secuencia de DNA con una usual alternativa de dos nucleótidos posibles a una posición dada. Para que tal posición de a base con la secuencia alternativa en el DNA sea considerada un SNP, se especifica que el alelo debe estar frecuente en, al menos, el 1% de la población [ 2].
Los SNPs son fuente potencial y poderosa de datos para investigaciones genéticas. Se cree en el área del entendimiento SNPs más que por la causa de uno solo. El estudio de la funcionalidad de un grupo de polimorfismos es de interés particular debido al alto volumen de datos que se manejan y por lo complejo de las interacciones que se toman. Se han desarrollado numerosas aproximaciones computacionales las cuales se han implementado para estudiar un SNP o para eleccionar una cohorte de estos [3].
Sin embargo, muchas veces se puede tener una gran cantidad de SNPs para una proteína y no poseer los equipos necesarios para trabajar con un número tan alto de ellos, ya que existen ciertos softwares que exigen equipos computacionales muy avanzados, por lo tanto, los candidatos para el estudio genético tratan de reducir el número de polimorfismos a aquellos genes que constituyen en su mayor(a la base génica de la enfermedad [ 1]. Hay SNPs que pueden considerarse de mayor importancia en comparación a otros ya que pueden corresponder a mutaciones ontrasentido que modifican la secuencia de aminoácidos de la proteína.
Estos cambios de base pueden tener efectos distintos para la proteína y sus funciones, ya sea desde cero alteraciones hasta llegar a la pérdida total de la funcionalidad proteica. La enzima PGKI es la sexta enzima de la vía glicolitica donde cataliza la reacción de transferencia de alta energía de un fosforllo del enlace ácido anhídrido del 1,3-bifosfoglicerato al p-fosfato de MgADP2_ La enzima humana posee una masa molecular de 45kDa y consiste de una simple cadena de polipéptidos de alrededor de 418 residuos [ 4].
En este trabajo nos enfocamos al estudio de SNPs por medio de diferentes softwares bioinformático 20F 18 En este trabajo nos enfocamos al estudio de SNPs por medio de diferentes softwares bioinformáticos para así poder evaluar si alguno de estos polimorfismos podrían dar lugar a una mutación benigna o maligna en la enzima participante de la glicolisis conocida como fosfoglicerato quinasa 1 (PGKI observando también el cambio en la energía libre que conlleva el polimorfismo de un aminoácido a otro, y como este cambio en la energía podría conllevar a inestabilidad termodinámica en la estructura enzimática.
MATERIALES Y METODOS Para la enzima PGKI se realizó la obtención de la secuencia de aminoácidos de la proteína en protein Data Bank (PDB), la cual es una base de datos cristalográfica de los datos estructurales tridimensionales de moléculas biológicas grandes, tales como proteínas y ácidos nucleicos. Los datos, generalmente obtenidos por cristalografía de rayos X, espectroscopia de RMN o microscopia crioelectrónica, son presentados por biólogos y bioquímicos de todo el mundo [ 5], además es de libre acceso en internet a través de la página http://www. rcsb. org/pdb/home/home. do.
En la páglna web se escogió el cristal de código 4033, con una resolución de 2. 1 A, además de un respectivo reporte de validación (Figura 1), el cual es la proteína PGKI extraída de humano en un complejo ternario con terazosina (TZN) [ 6], el cristal se obtuvo por cristalografía de rayos X y posee una sola cadena. Figura 1 . Reporte de validación del cristal de la proteína PGKI . A partir de la secuencia FASTA dada por PDB se analizaron los SNPs de PGKI con los siguientes tres programas online: Servidor web SIFT 5. 22: (Sortin 8 analizaron los SNPs de PGKI con los siguientes tres programas nline: Servidor web SIFT 5. . 2: (Sorting Intolerant From Tolerant) este software predice si una sustitución en la secuencia de aminoácidos de una proteína afecta su función mediante un análisis in Sllico por homología de secuencias teniendo en cuenta las propiedades físicas de los aminoácidos. Las sustituciones en cada posición que presenten un valor de índice de tolerancia menor a 0. 05 se asumen que afectan negativamente la función de la proteína y aquellos que son mayores o iguales a 0,05 se asume que serán tolerados y no afectan la función de la proteína de manera significativa 7].
Es de libre acceso en internet a través de la páglna http://sift. bii. a-star. edu. sg/index. html. Servidor web Polyphen versión 2: Es una herramienta que predice el posible impacto de una sustitución de un aminoácido en la estructura y función de una proteína utilizando consideraciones físicas y comparativas directas. En el análisis se utiliza la predicción HumVar como modelo de diagnóstico para enfermedades genéticas el cual distingue cambios de aminoácidos con un efecto drástico de cambios sin efecto en las proteínas [ 8].
A este software se puede acceder desde la web ttp://genetics. bwh. harvard. edu/pph2L Servidor web nsSNPAnalyzer: Es una herramienta para predecir si un cambio en un aminoácido tiene un efecto fenotípico. Utiliza la información contenida en la alineación de secuencias múltiples y la información contenida en las tres dimensiones de la estructura proteica para hacer predicciones; así mismo 40F 18 contenida en las tres dimensiones de la estructura proteica para hacer predicciones; así mismo la similitud y diferencia entre el aminoácido original y el cambio efectuado [ 9].
Este servidor se encuentra en la web http://snpanalyzer. uthsc. edu/. Al escoger los SNP más representativos, se investigaron en el servidor web Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) que reúne un catálogo de genes humanos y desórdenes genéticos. Contiene información en texto completo y referencias de art[culos y de otras obras sobre Genética, con enlaces a Medline y a recursos adicionales en NCBI.
Permite diversos tipos de búsqueda, tanto básica como avanzada, y está orientada a médicos e investigadores de genética [ 10], está disponible en internet a través de la páglna http://www. omim. org/. Se utilizó la secuencia PDB File (gz) tomada del PDB para el nálisis a nivel estructural de la proteína PGKI con el programa Swiss-PdbViewer (SPD3v), el cual proporciona una interfaz fácil de usar que permite analizar varias proteínas a la vez. Las proteínas se pueden superponer con el fin de deducir las alineaciones estructurales y comparar sus sitios activos.
Mutaciones de aminoácidos, enlaces de hidrógeno, ángulos y distancias entre los átomos son fáciles de obtener, gracias a la interfaz gráfica y el menú intuitivo que posee este software. Swiss-pdbViewer también puede leer mapas de densidad de electrones, y proporciona varias herramientas de modelado donde los residuos ueden mutarse, además de calcular su respectiva energía libre de Gibbs[ 11]. Después, se analizaron y descubrieron los aminoácidos catal[ticos del sitio ac Gibbs [ 11].
Después, se analizaron y descubrieron los aminoácidos catal(ticos del sitio activo de la proteína, además los aminoácidos que interactúan con el fármaco TZN, los cuales estaban incluidos en el cristal reportado por el PDB, todo esto con el programa UCSF Chimera el cual es un programa altamente extensible para la visualización y el análisis de las estructuras moleculares y los datos relacionados, incluyendo mapas de densidad, ensamblajes upramoleculares, secuencia de alineaciones, resultados de atraque, trayectorias, y conjuntos conformacionales, donde se pueden generar imágenes y animaciones de alta calidad [ 12].
Finalmente, con el programa Visual Molecular Dynamics (VMD) junto con los aminoácidos del sitio activo, se pudo identificar y representar las interacciones secundarias debidas al SNP observando así los aminoácidos potencialmente más perjudiciales para la enzima, que involucran cambios en los aminoácidos catalíticos. Es un programa de modelamiento molecular y visualización de estructuras.
VMD fue principalmente desarrollado como una herramienta para ver y analizar los resultados de las simulaciones de dinámica molecular, pero también incluye herramientas para trabajar con datos de volumen, secuencias y objetos gráficos arbitrarios como conos, cilindros o esferas [ 13]. RESULTADOS La PGKI es un polímero de una sola cadena polipept(dica que posee 417 residuos de aminoácidos, 21 hélices alfa y 18 hojas beta. Además, están reportados 42 polimorfismos de nucleótido simple o SNP.
De los cuales, se escogerá al final, aquel SNP que presente la mayor influencia negativa sobre la pro 60F 18 uales, se escogerá al final, aquel SNP que presente la mayor influencia negativa sobre la proteína. A cada SNP, se le realizó un análisis usando los diferentes programas, y se obtuvo así, una matriz de resultado presentado en la Tabla 1. Tabla 1. Matriz de resultados de cada SNP de la PGKI SNP Cambio SIFT POLYPHEN nssNP Energía (AG) OMIM N-36-T No tolerable Perjudicial Neutral 2 1-47-N perjudicial Enfermedad Favorable Rep. <-48-R N-225-S Benigno 26 K-246-E 27 1-253-T Tolerable 28 G -254-A 29 D-268-N 30 v. 278. M PAGt80f 18 mutación -28,876 -195,584 -10386,165 -10551,200 -40,885 242,240 -9852,988 0 -24,111 6924,677 3506,861 12 -21,374 7619,168 4920,482 -25,775 -180,353 -10526,754 32,298 94,753 -10257,653 21 23,586 18039,82 25607,301 proteína total (kJmol-1) Antes de la mutación Después de la mutación v-27 9,100 6932,930 3506,851 E_84 -29,697 7571,503 v-20 -32,242 17654,92 Figura 1 .
Aquí se muestran los resultados obtenidos en el software SPDBv a) Falta de interacción entre el aminoácido L88 y E84 b) Interacclón entre P88 y E84 c) Falta de interacclón entre Gl 58 y V20 d) Interacción entre aminoácidos Pl 58 y V20 e) Falta de interacción entre VEI y V27 y f) Interacción entre FBI yV27
