Asimilación del nitrógeno en los vegetales

Ing. Agr. María Pereyra Cardozo Facultad de Agronomía IJniversidad de La Pampa 2001 Asimilación del nitrógeno en plantas Las plantas superiores son organismos autotróficos que pueden sintetizar sus componentes moleculares orgánicos a partir de nutrientes inorgánicos obtenidos del medio ambiente. Para muchos nutrientes minerales, este proceso involucra la absorción por las raíces desde el suelo y la incorporación en compuestos orgánicos que son esenciales para el crecimiento y desarrollo.

Esta inc minerales en OF17 sustancias orgánicas nzimas, cofactores, lípidos, ácidos nuclei nomina asimilación de nutrientes. La asi quiere una serie compleja de re un alto costo energético. En la asimilación del nitrato (N03-), el nitrógeno del NOB- es convertido en una forma de energía superior, nitrito, (N02-), luego en una mayor forma de energía, amonio, (NH4+) y finalmente en nitrógeno amídico en la glutamina. Este proceso consume 12 equivalentes de ATPs por molécula de nitrógeno.

Por otra parte, las leguminosas que presentan una forma simbiótica con bacterias que transforman el nitrógeno atmosférico (N2) en amonio; proceso denominado, fijación biológica del nitrógeno junto con la subsecuente asimilación del amonio en os aminoácidos, consume 15 ATPs por nitrógeno. La mayor(a de los compuestos presentes en las células vegetales contienen nitrógeno, tales como. aminoácidos, nuc next page nucleósidos fosfatos, componentes de fosfolípidos, clorofila.

Solamente el oxígeno, carbono, y el hidrógeno son elementos más abundantes en las plantas que el nitrógeno. La mayoría de los ecosistemas naturales y agrícolas, al ser fertilizados con nitrógeno inorgánico, muestran importantes incrementos en la productividad, poniendo en evidencia la importancia de este elemento. Ciclo biogeoquímico del nitrógeno El nitrógeno está presente en diferentes formas en la biosfera (Figura 1). La atmósfera contiene aproximadamente un 78 % de nitrógeno molecular (N2).

Sin embargo, la mayor parte de este gran reservorio de nitrógeno no está directamenta dlsponible para los organismos. La adquisición del nitrógeno de la atmósfera requiere la ruptura del enlace triple covalente entre dos átomos de nitrógeno (NzN) para producir amonio. Estas reacciones de fijación del nitrógeno, puden ser procesos naturales o industriales, fijando el proceso natural aproximadamente 190 x 1012 g año-l de nitrógeno (Cuadro 1). Cuadro 1.

Los principales procesos del ciclo biogeoquímico del nitrógeno proceso Fljación industrial Fijación atmosfénca Fljación biológica Absorción por plantas Inmobilización Amonificación Nitrificación Mineralización Volatilización Fijación de amonio Denitrificación Lixiviación de nitrato Definición ritmo (1012 g año-l) Conversión inustrial de nitrógeno molecular a amonio 80 Conversión fotoquímica de nitrógeno molecular en nitrato Ig Conversión procariótica de nitrógeno molecular a amonio 170 Absorción y asimilación por las plantas del nitrato o amonio 1200

Absorción micro amonio 170 Absorción y asimilación por las plantas del nitrato o amonio 1200 Absorción microbiana y asimilación del amonio o nitrato NIC Catabolismo de la materia orgánica del suelo a amonio N/C (bacterias y hongos) Oxidación del amonio a nitrito (Nitrosomonas sp. ) y oxidación de nitrito a nitrato (Nitrobacter sp. Catabolismo de la materia organica del suelo a nitrógeno mineral a través de la amonificación o nitrificación (bacterias y hongos) Pérdida física de amoníaco gaseoso a la atmósfera 100 Fijación física de amonio en las part[culas del suelo 10 Conversión el nitrato en nitrógeno molecular (bacterias) 210 Flujo físico de nitrato disuelto en el agua del suelo 36 ATMOSFERA NITRÓGENO ATMOSFÉRICO Fijación industrial Tormentas eléctricas Plantas Desnitrificadores Animales Fijación biológica Compuestos nitrogenados en la lluvia NITRATOS Inmobilización por bacterias y hongos MATERIA ORGANICA MUERTA Organismos libres fijadores de N NITRITOS AMONIO Pérdida por lavado Mineralización SUELO Figura 1 . Ciclo biogeoquímico del nitrógeno (Taiz and Zeiger, 1998). Absorción del nitrato por I 30F17 La absorción de N03- está regulación positiva o de Cooper and Clarkson, 1989).

El transporte de N03- al citoplasma a través del plasmalema es un proceso termodinámicamente desfavorable, tanto en términos de gradiente de potencial eléctrico (interior negativo) y un gradiente de potencial químico [N03-]ext < [N03-]cit. Lo último está basado en estimaciones de la [N03-lcit las que varían entre 5-30 mM, mientras que los valores de [N03-] del suelo varían entre 0. 1 y 1. 0 mM (Henriksen and Spanswick, 1993). La absorción del N03- en las plantas terrestres está mediado al menos por tres sistemas de transporte que coexisten en las membranas plasmáticas de las células adicales. Estos sistemas pueden ser divididos en dos clases, referidos como sistemas de transporte de alta (STXA) y baja afinidad (STBA) por el N03- (baja y alta Km, respectivamente). por otra parte, los STAA pueden ser constitutivos 2 (STAAC) o inducibles (STAN).

LOS STBA están involucrados en la absorción de altas concentraciones de N03- 0. 2mM), mientras que los STAAI y los STAAC están saturados con una baja concentración de N03- externa (aproximadamente 100 PM) (Figura 2). En ra(ces de cebada, la actividad de los STBA es expresada sin una exposición previa al N03- y este sistema de ransporte estaría regulado negatlvamente por el nltrógeno acumulado en la planta (Vidmar et al. 2000). El movimiento pasivo del nitrato a través de las membranas plasmáticas es probablemente vía canales iónicos; un canal permeable al nitrato el cual permite el flujo de aniones hacia la célula ha sido identificado en la membrana plasmática de protoplastos de trigo.

Tal canal p célula ha sido identificado en la membrana plasmática de protoplastos de trigo. Tal canal podr(a tener un rol en el sistema de absorción constitutivo. Aparentemente aunque la absorción pasiva sólo produzca concentraclones micromolares de nitrato en l citoplasma, éstas serían suficientes para inducir el transporte y asimilación del nitrato, sin la necesidad de un receptor de nitrato fuera de la célula (figura 3) (Miller and Smith, 1996). Un canal de aniones también puede ser el mecanismo para la salida de nitrato. La dirección del flujo de aniones a través de un canal está determinada por el gradiente electroquímico del ión.

La regulación de la actividad de un canal aniónico en la membrana plasmática podría ser importante en determinar la concentración de nitrato en el citoplasma, dado que si el transporte activo se antiene, la salida a través del canal disminuirá rápidamente la concentración de nitrato en el citoplasma. un canal abierto tiene una permeabilidad selectiva permitiendo que algunos iones fluyan pasivamente en función del gradiente electroquímico a un gran ritmo (106- 108 iones seg-l). Un simple canal de aniones abierto con un ritmo de salida de 107 iones seg-l permitirá la caída de la concentración de nitrato citoplasmático de 4 mol m-3 a un valor de mmol m-3 (distribución pasiva del nitrato) en 50 – 200 segundos. por otra parte, el transporte activo es requerido n las membranas plasmáticas para mantener la concentración intracelular de nitrato.

La fuerza protón motriz a través de la membrana plasmática puede proveer la energía necesaria para el transporte a través de la membrana plasmatica puede proveer la energía necesaria para el transporte de nitrato. Se considera que el transporte de nitrato es un simporte con (figura 3). Las proteínas de los STAAI, son de 507 a 509 aminoácidos, con una masa molecular de 54 a 55 kD, incluyendo 12 regiones hidrofóbicas (transmembranas). Ha sido mostrado que el nivel de ARNm de estas proteínas aumenta rápidamente en respuesta l suministro de N03- en plantas que crecían en condiciones con limitaciones de N03-. El incremento en el nivel de transcriptos está correlacionado con el incremento en el ingreso de N03-.

Los genes involucrados en la adquisición y reducción del N03- fueron coordinadamente expresados bajo condiciones de inducción por N03- . por otra parte, la abundancia de los transcriptos está regulada por un efecto feedback de las formas reducidas del nitrógeno más que por el nivel de nitrato. A nivel fisiológico la inhibición de los STAAI en un bajo estado estacionario después de alcanzar un pico de inducción ha sido argumentado que es el esultado de efectos de la acumulación de N03- y/o los productos de su asimilación. Esta conclusión está basada en correlaciones entre la [ N03-]en la célula y el ingreso de N03-. Existen evidencias que el ingreso de [ N03-] es inhibido por el NH4+ celular y lo los amnoácidos.

Siendo regulado la absorción de nitrógeno por el ciclo de los aminoácidos entre la raíz , tallo y raíz (Cooper and Clarkson, 1989) (Figura 4). Mecanismos de transporte en el tonoplasto Análisis de vacuolas aisladas de hojas de cebada han demostrado que entre el 58% y 99 tonoplasto que entre el 58% y 99 % del nitrato protoplástico se encuentra n la vacuola. En consecuencia, un transporte activo es necesario para explicar la concentración de nitrato dentro de la vacuola, siendo aparentemente un antiporte N03- / H+, mientras que un canal abierto permitiría la salida pasiva del ión nitrato hacia el citoplasma. En consecuencia el control de la concentración de nitrato en el citoplasma ocurre por una «liberación» más que por un bombeo.

Dicha regulación podría requerir una interacción directa entre el nivel de nitrato en el citoplasma y la actividad del canal, probablemente por la fosforilación del canal permitiendo su apertura (Mlller and Smlth, 1996). Asimilación del nitrato Las plantas asimilan la mayor parte del nitrato absorbido por sus raices en compuestos orgánicos nitrogenados. La primera etapa de este proceso es la reducción de nitrato a nitrito en el citoplasma. La enzima nitrato reductasa (NR) cataliza la siguiente N03- + + N02_ + AG = – 34. 2 Kcal/mol; = 0. 74 voltios en la que se observa un gran cambio de energía libre bajo condiciones estándar, siendo una reacción irreversible. La NR- NADPH (Ec. 1. 6. 6. ) está presente en las plantas superiores y en algas, las formas NAD(P)H se encuentran en algas, hongos y plantas superiores y la forma specifica de NADPH se encuentra en hongos. En las hojas la NR es NADH dependiente, mientras que en la raíz existen dos formas NADH y NADPH dependientes. La nitrato reductasa cataliza el p mientras que en la raíz existen dos formas NADH y NADPH dependientes. La nitrato reductasa cataliza el primer paso de la asimilación del nitrato en todos estos organismos, el cual parece ser el proceso que limlta la adquisición de N en la mayoría de los casos, siendo esta enzima regulada por el N03- y la luz entre otros factores.

La enzima NR es un homodímero compuesto de 2 subunidades idénticas de 100 kDa aproximadamente cada na, conteniendo cada subunidad tres grupos prostéticos: un equivalente de FAD (flavina aden(na dinucleótido), hemo-Fe y un complejo de Molibdeno (Mo) . El molibdeno está unido a la enzima por un complejo orgánico llamado pterina formando el Mo-molibdoterina (Mo-MPT). En consecuencia, la enzima contiene tres cofactores internos: FAO, hemo y MPTy dos iones metálicos: Fey Mo en cada subunidad (Figura 5). Durante el recambio catalítico el FAD, el Fe y el Mo son cíclicamente reducidos y oxidados, de manera que la NR existe en formas reducidas y oxidadas. Los potenciales redox para el FAD, hemo-

Fe y MO-MP son -272 a -287 mv, -123 a -174 mvy -25 a 15 mV, respectivamente. Este patrón redox es consistente con un flujo de electrones, dentro de la enzima desde el NADH con un potencial redox de -320 mV hasta el sitio activo donde se reduce el N03- con un potencial redox de + 420 rnV. por lo que, la NR es una proteína soluble que cataliza una reacción redox, involucra una cadena transportadora de electrones y tiene dos sitios activos físicamente separados, uno para el NADH para reducir el FAD al comienzo de la cadena transportadora de electrones y uno par para reducir el FAD al comienzo de la cadena transportadora de lectrones y uno para reducir el nitrato por la MO-MPT.

Dado que el nitrlto formado es altamente reactivo, siendo un ión potencialmente tóxico, las células vegetales lo transportan inmediatamente después de ser generado por la reducción del nitrato desde el citoplasma a los cloroplastos en las hojas, y a los plástidos en las raíces. En estas organelas la enzima nitrito reductasa reduce el nitrito a amonio, siendo la reacción que cataliza: N 02- + 6 + 8 H+ N02- + + 8 H+ + Fdox + 2 H20 NH4+ + NADPH+ 2 H20 Donde Fd indica ferredoxina reducida (red) y oxidada (ox). La ferredoxina reducida deriva del transporte de electrones de la otosíntesis en los cloroplastos y el NADPH generado por la vía oxidativa de las pentosas fosfatos en los tejidos no fotosintéticos. La nitrito reductasa es una poteína simple de 63 Kda y contiene dos grupos prostéticos, un complejo de Fe-S (Fe4S4) y un grupo hemo especializado.

Experimentos cinéticos sugieren que el par Fe4S4-hemo de la enzima se unen al nitrito y lo reducen directamente a amonio. De manera que el flujo de electrones desde la ferredoxna hasta el nitrito puede ser representado como se observa en la figura 6. 4 Asimilación del amonio Las células vegetales evitan la toxicidad del amonio ncorporándolo rápidamente en los esqueletos carbonados para formar aminoácidos (Figura 7 y 8). El paso primario de esta incorporación involucra las acciones secuenciales de la glutamina sintetasa y la glutamato sintetasa. La glutamina sintetasa CGS) combina el a secuenciales de la glutamina sintetasa y la glutamato sintetasa.

La glutamina sintetasa (GS) combina el amonio con glutamato para formar glutamina: Glutamato + NH4+ + ATP glutamina + ADP + Pi Esta reacción requiere la hidrólisis de un ATP e involucra cationes divalentes como el Mg2+, Mn2+ o C02+ como cofactores. La GS tiene un peso molecular de 350 kDa y está compuesta por subunidades aproximadamente idénticas. La GS tiene una alta afinidad por el NH4+ siendo la Km de 3-5 pM. Las plantas contienen dos clases de GS, una en el citoplasma y otra en los plástidos de las raíces o en los cloroplastos de tallos y hojas. Las formas citosólicas son expresadas durante la germinación de las semlllas o en las células vasculares de raíces y tallos y producen glutamina para el transporte intracelular de nitrógeno.

La GS en los plástidos de raíces genera nitrógeno amídico para su consumo; mientras que la GS de los cloroplastos de los tallos reasimila el NH4+ producido por fotorespiración. Al aumentar el nivel de glutamina aumenta la actividad de la glutamato sintasa (también conocida como glutamina 2 – oxoglutarato aminotransferasa, o GOGAT). Esta enzima transfiere el grupo amida de la glutamina al a ceto glutarato, dando 2 moléculas de glutamato. Las plantas contienen dos tlpos de GOGAT, una que acepta los electrones del NADH, la otra acepta electrones de la ferredoxina: Glutamina + a – ceto-glutarato + NADH + H+ Glutamina a – ceto-glutarato Fdred 2 glutamato + NAD•• 2 glutamato + Fdox La NADH-GOGAT está ubicada en los plástidos de los tejidos no fotosintéticos tales com