By APLICACIONES FORENSES DEL ADN Lourdes Prieto Solla Comisaría General de Policía Científica Laboratorio de ADN INTRODUCCIÓN Actualmente la pericia genética realizada sobre restos biológicos es una actividad rutinaria en el entorno forense. El análisis de muestras involucradas en ciertos delitos puede ayudar a esclarecer cómo ocurrieron los hechos o quienes intervinieron en los mismos.
Asimismo, la aplicación de técnicas moleculares en la identificación de cadáveres ha permitido resolver aquellos casos que no pod[an solventarse mediante técnicas clásicas de dentificación (huella dactilar, ficha dental, etc). Este tipo de pericias se caracteriza por su objetividad, ya que se basan en fundamentos científicos plenamente demostrados y validados.
Los resultados que se obtienen en el análisis de evidencias en un laboratorio, por tanto, han de coincidir plenamente con los obtenidos en otros diferentes, si todos son científicamente rigurosos y cumplen con las condiciones de calidad. En este sentido es de gran importancia asegurarse de que la pericia se realiza en un laboratorio debidamente acreditado. Si bien actualmente la identificación genética es una e las pruebas más importantes al servicio de la Justicia, hemos de reconocer que una de las principales limitaciones que tiene es el factor tiempo.
A diferencia de otras pruebas de carácter identificador de gran relevancia en épocas anteriores (como la huella dactilar), el análisis de ADN no ofrece resultados con la rapidez deseada, pues los protocolos exigen unos tiempos minimos e en el tratamiento de las muestras. Sin embargo, hemos asistido a una gran evolución de la genética molecular en las últimas décadas y por ello no debemos descartar que algún día quizá la ?prueba del ADN» sea prácticamente inmediata. Asf lo deseamos todos los que nos dedicamos a tan interesante especialidad.
BREVE INTRODUCCIÓN AL CONCEPTO, TIPOS Y VARIABILIDAD DE ADN Para entender cómo se realizan los análisis moleculares con fines identificadores y cómo se Interpretan los resultados introduciremos brevemente y de la manera más sencilla posible el concepto de ADN (ácido desoxirribonucleico), los tipos de ADN que podemos estudiar y cómo varía entre los individuos. La molécula de ADN se localiza dentro de la mayoría de las células que forman los diferentes tejidos de un individuo. Se trata de una molécula muy larga compuesta por unos 3000 millones de unidades llamadas nucleótidos.
La forma más sencilla de pensar en una molécula de ADN es imaginar una larga cadena formada por 3000 millones de eslabones (nucleótidos). Dentro de cada célula, la mayor parte del ADN se encuentra en un compartimento denominado núcleo, separado del resto (citoplasma) por una membrana llamada nuclear. La cadena de ADN se encuentra empaquetada, formando unas estructuras denominadas cromosomas (figura 1). En los humanos existen 23 pares de cromosomas, 22 de ellos enominados autosomas y el par restante corresponde a los cromosomas sexuales.
En las mujeres este par está formado por dos cromosomas similares denominados X (par XX) y en los varones está compuesto por un cromosoma X y un cromosoma Y (par XY). El ADN cromosómico (tanto autosómico como sex 2 OF SI compuesto por un cromosoma X y un cromosoma Y (par XY). El ADN cromosomico (tanto autosómico como sexual) se llama ADN nuclear (ADNn) y existen únicamente 2 copias del mismo en cada célula (simplificando, una procedente del padre y otra procedente de la madre). En genética forense se estudian fragmentos de
ADN que están situados tanto en los autosomas como en los cromosomas sexuales (XV). Dado que el cromosoma Y sólo existe en varones, es importante conocer cómo se hereda; todos los individuos varones emparentados por línea paterna comparten el cromosoma Y (casi en su totalidad) pues se hereda directamente de padres a hijos sin mezclarse con ningún material procedente de la madre (figura 2A). Por tanto, no es posible identificar individuos mediante el estudio de su cromosoma Y, sólo es posible identificar linajes paternos.
Además del ADN nuclear existe otro tipo de ADN denominado ADN mitocondrial (ADNmt) mucho más corto (unos 16500 eslabones) localizado dentro de unos orgánulos celulares llamados mitocondrias presentes en el citoplasma. Existen numerosas mitocondrias en cada célula y varias copias de ADNmt en cada mitocondria, es decir, existe mayor cantidad de copias de ADNmt que de ADNn por célula. Este hecho hace que en muestras forenses muy criticas (con escasa cantidad de ADN o con ADN en mal estado) tenga más éxito el análisis de ADNmt que el estudio de ADNn.
Sin embargo, el ADNmt presenta un peculiaridad, se hereda única e integramente de la madre, es ecir, todos los individuos relacionados familiarmente por vía materna presentan idéntico ADNmt (figura 28). Por tanto no permite la identificación de individuo 3 OF SI presentan idéntico ADNmt (figura 23). Por tanto no permite la identificación de individuos, sino de líneas familiares maternas. Los eslabones que forman la cadena de ADN pueden ser de cuatro tipos, por ejemplo podemos imaginar que son de cuatro colores diferentes (hay cuatro tipos de nucleótidos llamados Adenina o A, Timina o T, Citosina o Cy Guanina o G).
El orden o secuencia de estos tipos de eslabones a lo largo de oda la cadena es prácticamente igual en todos los humanos pero existen algunas zonas de la cadena que difieren de unos individuos a otros. Estas zonas llamadas polimórficas son las que nos interesan en genética forense para poder diferenciar unas muestras de otras. Por tanto, no es interesante analizar la molécula de ADN completa, principalmente por dos razones: (i) tardaríamos mucho tiempo y (ii) la mayor parte de la molécula es común en todos los humanos y no podríamos distinguirlos.
A cada fragmento variable de ADN que estudiamos en identificación genética lo denominamos marcador, sistema o ocus (loci, en plural) y los alelos son las variantes («posibilidades») que tiene cada uno (figura 3). Cada marcador tiene un nombre propio que suele hacer referencia a su localización dentro de la molécula de ADN, por otro lado, la mayoría de los alelos de cada marcador se representan con números (tabla 1). MARCADOR POBLACION ESPANOLA HUMTHOI IOy11 CSFI po 13, 14)/ 15 ALELOS DETECTADOS EN LA 5, 6, 7, 8, 9, 9. , 12, D8S1179 15, 16, 17y18 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14′] 15 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, TABLA 1. Ejemplos de marcadores utilizados en genética forense y sus alelos en población española. Cada individuo hereda un alelo de su madre y otro de su padre. Si los alelos heredados en un marcador concreto coinciden diremos que el Individuo es homocigoto y si difieren se tratará de un heterocigoto (figura 4). Así, un individuo que herede de ambos progenitores el alelo 7 en el marcador THOI será homocigoto 7-7 y otro que herede el alelo 7 de su madre y el g de su padre, será heterocigoto 7-9.
Como puede suponerse hay que analizar varios marcadores en una muestra para poder identificarla pues dos muestras distintas pueden coincidir por simple azar en los alelos de un marcador. A mayor de número de marcadores analizados, mayores posibilidades de distinguir dos muestras sin error. El perfil genético de un individuo o de una evidencia es la sucesión de los alelos que presenta en cada marcador (tabla 2). MUESTRA THOI TPOX CSFIPO D3S1358 VWA FGA D8S1179 D21S11 D18S51 D5S818 D13S317 D7S820 SEXO 6-9. 8-11 10-10 16-16 16-17 20-21 10-13 30-30 14-15 12-12 10-11 10-10 XY Tabla 2. Perfil genético de una muestra biológica Actualmente se estudia un número suficiente de marcadores para distinguir unas muestras de otras. La mayoría OF SI marcadores para distinguir unas muestras de otras. La mayoría de laboratorios forenses utilizan los mismos marcadores con el fin de intercambiar datos sin tener que reanalizar las muestras.
CONCEPTO DE MUESTRAS DUBITADAS E INDUBITADAS Para que una pericia genético biológica sea concluyente es imprescindible desarrollar el análisis en dos tipos de muestras: a) Muestras dubitadas o evidencias: son restos biológicos de procedencia desconocida, es decir, no sabemos a quién pertenecen (por ejemplo las muestras recogidas en la escena del delito o de un cadáver sin identificar). b) Muestras indubitadas o de referencia: son restos biológicos e procedencia conocida, es decir, sabemos a quién pertenecen (por ejemplo la sangre tomada de un cadáver identificado, o las muestras tomadas a familiares de un desaparecido).
La analítica de ADN se ha denominado en múltiples ocasiones «huella genética»; este término no debe llevarnos a confusión pues, si bien es verdad que cada individuo presenta un ADN diferente (como en el caso de las huellas dactilares), no existe una base de datos formada por las características genéticas de cada individuo que vive en España (a diferencia de la huella actilar, de la cual existe un registro del índice derecho de todas las persona con DNI). por este motivo, sólo podremos identificar las evidencias biológicas si disponemos de muestras de referencia para su comparación.
Los tipos de muestras dubitadas más frecuentemente analizadas por técnicas genético moleculares son (figura 5): sangre (habitualmente en forma de mancha), semen (lavados vaginales o manchas sobre prendas de la víctima), saliva (colillas 6 OF SI forma de mancha), semen (lavados vaginales o manchas sobre prendas de la víctima), saliva (colillas de cigarrillo, chicles, obres y sellos), pelos, uñas, tejidos blandos, restos óseos y dentarios (estos últimos relacionados fundamentalmente con la identificación de cadáveres). El tipo de muestras indubitadas más habituales son sangre y saliva (frotis bucal).
No es necesario que las muestras de referencia sean del mismo tipo que las evidencias, es decir, podremos comparar distintos tipos de restos biológicos entre si ya que el ADN es igual (salvo excepciones) en todos tejidos de un mismo individuo. Podemos diferenciar tres etapas principales en el análisis de una muestra forense (figura 6): i) pruebas preliminares para determinar la naturaleza y el organismo de procedencia de la muestra; (ii) análisis del ADN presente en la muestra con fines identificadores y (iii) análisis e interpretación de los resultados obtenidos.
PRUEBAS PRELIMINARES EN LAS PERICIAS GENÉTICO-BIOLÓGICAS Antes de realizar un estudio de ADN con el fin de individualizar las evidencias existen pasos previos en la analítica que nos permiten discriminar el tipo de resto biológico ante el que nos encontramos. Ello se logra a través de las pruebas preliminares, que si bien son más sencillas que el propio análisis del ADN resente en una muestra, no por ello son menos importantes.
El peso de la evidencia varía segun se trate de un tipo de resto biológico u otro, es decir, no es lo mismo hallar una mancha de sangre (que puede implicar lucha) que un filtro de cigarrillo (que simplemente puede indicar la presencia de un individuo en la escena del del 7 OF SI cigarrillo (que simplemente puede Indicar la presencia de un individuo en la escena del delito, pero no necesariamente su participación activa en él). Sin embargo, en cada caso las circunstancias son diferentes y muestras biológicas que quizá no engan relevancia en un hecho delictivo la pueden tener en otro distinto.
Existen fundamentalmente tres tipos de pruebas preliminares (figura 6): a) Orientativas: se trata de técnicas que nos revelan la posible naturaleza de la mancha pero no nos la aseguran, es decir, sirven sólo para descartar, pero no para concluir. Por ejemplo, la llamada reacción de Adler es una sencilla prueba colorimétrica que si resulta positiva nos orienta a pensar que estamos ante una mancha de sangre, pero sin poder asegurarlo pues existen otras sustancias (jugos vegetales, óxido, lejía) que también dan positiva sta reacción.
Si la prueba resulta negativa podremos asegurar que el resto que estamos analizando no es sangre. Estas pruebas son sencillas de realizar, son de bajo coste, muy rápidas, y nos ayudan a seleccionar las manchas a analizar. b) De certeza: nos permiten determinar el tipo de resto biológico analizado con seguridad. La detección de hemoglobina en la muestra para determinación de sangre o la visualización al microscopio de espermatozoides para la determinación de semen son algunos ejemplos (figura 7). c) Especificas: nos permiten determinar el tipo de organismo l que pertenece el resto biológico.
Una vez que hemos determinado el tipo de muestra que hemos de analizar, interesa saber si se trata de una muestra humana o no. Existen principalmente dos tipos de pruebas especificas: unas trata de una muestra humana o no. Existen principalmente dos tipos de pruebas específicas: unas basadas reacciones antígeno- anticuerpo y otras basadas en el estudio de ciertas regiones del ADN, si bien, en cierto tipo de muestras (pelos, restos óseos) puede realizarse un estudio de las características morfológicas para determinar el tipo de organismo.
En el caso de que nos encontremos ante una muestra de origen animal, normalmente los análisis terminarán en este punto a no ser que el objetivo sea precisamente determinar la especie (por ejemplo, en caso de delitos ecológicos y de caza furtiva). En el caso de muestras de origen humano se procederá a realizar la segunda etapa del estudio destinada a Individualizar la muestra mediante técnicas de ADN. Conviene señalar que en determinadas ocasiones no es posible determinar el tipo de resto biológico hallado por la escasa cantidad de muestra disponible.
En estos casos se suele proceder irectamente a realizar los estudios de ADN para intentar individualizar la muestra. INDIVIDUALIZACION DE LAS MUESTRAS BIOLOGICAS Actualmente, para determinar a qué individuo pertenece una muestra biológica se recurre al estudio de parte de su ADN. La molécula de ADN se localiza dentro de las células que forman los diferentes tejidos de un individuo y para poder analizarla, previamente hay que aislarla separándola del resto de componentes celulares.
A pesar de que en una primera fase aislaremos la molécula completa, posteriormente sólo estudiaremos ciertas regiones de ella, concretamente las onas más polimórficas («marcadores», «sistemas» o «loci» polimórficos). La analítica de ADN se realiz OF SI polimórficas («marcadores», «sistemas» o «loci» polimórficos). La analítica de ADN se realiza en cuatro fases (figura 6): a) Extracción de ADN: consiste en separar la molécula de ADN del resto de componentes celulares.
Se trata de un paso fundamental en el análisis genético de muestras forenses, pues el éxito del estudio puede verse afectado en gran medida si no se realiza un buen aislamiento de la molécula. Existen gran cantidad de ustancias que pueden interferir en este proceso, bien de los propios reactivos utilizados durante la extracción o bien de los soportes en los que se encuentran situados las manchas biológicas.
La duración y rendimiento de este proceso también depende en gran medida del tipo de resto biológico que se está analizando. Así, a partir de las muestras de sangre o de saliva el proceso de extracción es más rápido que a partir de un resto óseo o dentario donde el ADN es menos accesible. b) Cuantificación de ADN: una vez que hemos finalizado la extracción se realiza la cuantificación para saber qué cantidad e ADN hemos logrado aislar y en qué estado se encuentra (completo o roto). ) Amplificación de ADN: consiste en copiar muchas veces el fragmento concreto de ADN que queremos estudiar para obtener una cantidad adecuada que nos permita su detección. Este proceso se denomina PCR (polymerase chain reaction) y gracias a él podemos analizar pequeñas cantidades de muestra biológica. Normalmente se amplifican varios fragmentos de ADN en paralelo para evitar agotar la muestra y para conseguir una mayor rapidez en el análisis (multiplex PCR). d) Detección del producto amplificado o tipaje: esta es la fase f 0 DF 52
